PBC Basics: Labormethoden

0:41 Und wir stellen uns das jetzt bitte alle wirklich bildlich vor, wieder so jemand richtig schwarz angezogen, schwarze Fingernägel, lange Haare, so ein langer Ledermantel. Der sitzt auf einem kleinen roten Trecker. Klein roter Traktor heißt es.

1:09 So Freunde, heute ab ins Labor. Ihr seid hoffentlich genauso heiß, wie wir drei, mir sind heute mit mir bereit, in die Tiefen der Labormethodik einzusteigen. Wir sind ultra heiß. Denn das an Basiswissen braucht man halt eben auch im Medizinstudium. Auch wenn man gar nichts mit Labor am Hut haben will, braucht man es trotzdem.

1:29 Und für die, die später mal Professor Doktor sonst was werden wollen, ist natürlich jetzt ein super Einstieg auch dafür. Der Einstieg, eine Selbstverständlichkeit. Genau, ja. Also für die nächste Nobelpreisrede, Freunde, wisst ihr, wenn ihr zitieren müsst. Ach, das unangenehm. Wir müssen hoch einstecken.

1:51 Genau, fürs Biochemie-Praktikum und für alles andere, was im Labor stattfindet, sollte man halt eben so ein paar Grundmethoden schon mal gehört haben. Und deswegen wollen wir die für euch so ein bisschen zusammensortieren, weil die ja dann noch immer hier und da mal auftauchen. Und deswegen hier das Ganze einmal zusammen zu schneiden.

2:12 Und wir möchten quasi heute, so wie ich es verstanden habe, mich als Versuchskaninchen nehmen und quasi einmal mein komplettes Erbgut auseinanderbauen.

2:19 Und das war so ein bisschen mein Plan, dass wir Leo mal zerlegen und schauen, was wir mit verschiedenen Körperteilen und Flüssigkeiten anfangen können.

2:27 Was da so ans Licht kommt.

2:30 Genau. Ihr werdet allgemein dabei merken, dass man oft ähnliche Dinge macht, aber mit verschiedenen Stoffen oder etwas anderer Auswertungsformen. Ganz am Anfang nochmal kurz das zentrale Dogma der Molekularbiologie. Es geht noch auf Francis Crick zurück. Und grundsätzlich ist ja das Verständnis, man geht von der DNA über Replikation, kriegt man neue DNA.

2:57 Ja, und wenn man die DNA dann transkribiert, dann bekommt man RNA und wenn man die RNA dann translatiert, zumindest die mRNA, dann bekommt man ein Protein. Und genau so wollen wir jetzt auch vorgehen, dass wir erstmal schauen, was man mit der DNA machen kann und dann später mit Proteinen. Dann schauen wir aber auch noch Lipide an.

3:15 Und dann haben wir einen ganz guten Überblick über das, was auch in der Vorklinik von euch verlangt wird.

3:24 Ganz kurze Werbung.

3:26 Gerade beim Faktenlernen habe ich immer wieder mal so richtig Motivationsprobleme. Und meine Methode to go ist es deswegen, abwechselnd verschiedene Kanäle anzusteuern. Den Vorklinik-Podcasts gibt es also auf die Ohren und Meditrix bietet den perfekten visuellen Input aus Merkbildern und Erklärvideos.

3:42 Und das löst jetzt nicht nur meine Motivationsproblem, sondern verknüpft auch noch diese Lerninhalte und führt deswegen nachhaltig zum Erfolg. Und vor allem in Kombi mit dem 30 bzw. 50 Tage Physikumslernplan bietet Meditrix eigentlich den perfekten Begleiter durch die Vorklinik.

3:57 Wenn ihr Lust bekommen habt, Meditrix mal auszuprobieren, dann klickt euch jetzt mit dem exklusiven Code SIDUSINVs15. 15% Rabatt auf euer nächstes Meditrix-Abo. Silusin versus 15. Jetzt sichern. Das war's schon. So, dann nehmen wir erstmal Blut ab, weil ich glaube, heutzutage macht man das aus Blut, ne?

4:19 So DNA-Extraktion.

4:20 Ne, ich wollte eigentlich eine Brobe aus deiner Mundschleimhaut, damit wir dir so ein bisschen was Verschiedenes machen. Okay, dann also Mundschleimhaut. Das habe ich letztens erst gemacht in so einem Skills Lab, das schab man dann stundenlang gefüllt mit so einem Schaber in diesem, halt im Mund an deiner Wange rum, bis du dann irgendwann so ein paar, so ein bisschen Material gesammelt hast.

4:38 Ah, let's go.

4:39 Ich glaube, das Gefühl hast du gerade so ein bisschen weggenuschelt, aber also in der Realität sind es jetzt vielleicht nicht ganz Stunden, aber doch wirklich eine ganze Weile. Das ist auch echt unangenehm, finde ich. Ja.

4:49 Aber dann haben wir jetzt auf jeden Fall eine Probe von Leos DNA. Let's go.

4:53 Yes, okay, genau. Also jetzt geht es erstmal um die DNA. Was kann man, welche Eigenschaften kann man darüber bestimmen? Einmal quantitativ die Menge einer DNA in der Probe, ganz logisch, und qualitativ die Länge von DNA-Stücken, genauso wie die Basensequenz kann man dann eben auch bestimmen. Dann ist es so, wie kann man jetzt DNA-Proben gewinnen?

5:12 Zum einen zum Beispiel jetzt ja durch Biopsien in verschiedenen, aus verschiedensten Körperregionen, theoretisch wäre das möglich, macht man in der Praxis jetzt nicht von überall. Aber man kann dann eben das Ganze auskochen mit verschiedenen Reagenzien. Und genau, in dem Fall jetzt heute, nehmen wir mal eine Probe aus Leos Mondschleimhaut und um die DNA genauer analysieren zu können, müssen wir sie erstmal vervielfältigen.

5:36 Also wenn wir jetzt nur so ein ganz kleines Mini-Bisschen haben, sehr elokument ausgedrückt, dann ist die Sensitivität der Analysemethoden einfach zu gering. Daher brauchen wir die berühmte PCR, also die Polymerase-Kettenreaktion.

5:52 Wir wissen ja, dass die DNA eine antiparallele Doppelhelix ist. Und im Prinzip trennt man bei der Polymerase-Kettenreaktion in jedem Schritt die komplementären, also die gegenüberliegenden DNA-Stränge und fügt dann zu jedem Einzelstrang einen neuen komplementären Strang hinzu, sodass man die DNA effektiv in jedem Schritt verdoppelt.

6:16 Man benötigt dafür dann immer zwei Primer, die an einen DNA-Einzelstrang binden können. Das müssen so kurze, komplementäre Sequenzen sein. Das heißt, man muss auch einen Teil der DNA zumindest kennen, nämlich den Teil, wo man die Primer ranbinden möchte, weil man ja dementsprechend komplementäre Primer braucht.

6:38 Man hat jetzt pro DNA-Einzelstrang zwei Primer. Und die bestimmen die Grenze des DNA-Stücks, was wir amplifizieren möchten. Also einer ist eben Upstream und einer Downstream. Und natürlich ist pro Einzelstrang hat man dann den einen Primer und auf dem anderen komplementären Einzelstrang den anderen. Und letztendlich, das muss man sich lieber in der Grafik anschauen, weil ich glaube, das kann ich gerade schwer erklären, aber letztendlich wird dann nur das Stück zwischen den beiden Primern effektiv vervielfältigt.

7:07 So. Die, wie gesagt, man muss schon ein Stück der DNA kennen und dafür gibt es später noch die Sequenzierung. Da kommen wir dann noch drauf. Man braucht neben den Primern auch noch eine Pufferlösung. Und innerhalb dieser Pufferlösung befinden sich vor allem die Desoxiribonukleotide. Es gibt ja die Basen A, T, G und C und die sind da zusammen mit ihren Zuckern und den Phosphaten, die da dran gebunden sind.

7:39 Und das stellen wir uns jetzt einfach mal wie so vier verschiedenfarbige Lego-Steine vor. Außerdem braucht man in der Pufferlösung auch noch eine hitzestabile DNA-Polymerase. Die gewinnt man aus thermophilen Bakterien, die in so heißen Quellen leben. Ich weiß nicht, aus welcher Region der Erde die kommen, aber finde ich auf jeden Fall spannend.

8:01 Behaupte, da wo Wasser ist. Glaubst du? Da, wo Wasser ist?

9:16 Ja, sonst gibt es keine Quellen, oder? Gibt es nicht überall Wasser.

9:23 Naja, auf jeden Fall braucht man außerdem noch Magnesium als Kofaktor und dann haben wir unsere Pufferlösung.

9:29 Genau, und dann kommt eben, dann folgt immer wieder der gleiche Zyklus. Als erstes starten wir mit der Denaturierung, also es kommt zu einem Erhitzen auf etwa 95 Grad Celsius und dann werden die DNA-Doppelstränge in Einzelstränge getrennt. Also die Verbindungen, die Wasserstoffbrückenbindungen, die zwischen den Basen, also die Basenpaare verbinden, die werden gekappt.

9:50 Und im nächsten Schritt kommt es dann zum Annealing, also hier bindet dann dieser Primer, der Oligonukleotid-Primer. Die Temperatur ist jetzt primerabhängig bei etwa bei 50 Grad Celsius. Und im letzten Schritt kommt es zur Elongation. Dabei kommt es, also die Polymerase, die verlängert eben den DNA-Strang ab dem Dreistrich-Ende des Primers und es entsteht dann wieder eine doppelsträngige DNA.

10:15 Und danach kommt es eben zu einer Auftrennung dieses DNA-Gemischs, was wir jetzt gerade gewonnen haben, mit Hilfe einer Gel-Ektrophorese. Jetzt sage ich mir das Wort super witzig. Ich habe immer Gel-Elekrophorese. Also das ist einfach super. Naja, auf jeden Fall, die DNA wird dann eben abhängig von ihrer Masse, also von der Anzahl der Basenpaare, mehr oder weniger weit auf dem Gel in Richtung Anode befördert.

10:38 Und dann kann man eben am Ende erkennen, ob beispielsweise ein bestimmtes Gen mit so und so vielen Basenpaaren vorhanden ist und ob es vervielfältigt wurde oder nicht. Also es ist jetzt ein qualitativer Nachweis.

10:50 Genau, und das ist wirklich ein wichtiger Punkt, ja. Also die Gel-Elektrophorese, die muss auch nicht zwangsläufig auf die PCR folgen, macht man aber in der Regel, um dann auch entsprechend die Banden zu sehen und eben zu erkennen, ob ein bestimmtes DNA-Fragment überhaupt vorhanden war. Man hat hier also den qualitativen Nachweis im Sinne von, gab es dieses Stück DNA, was ich hier mit meinem Primer vervielfältigen wollte?

11:19 Und wenn wir jetzt, das Ganze läuft immer in so einem Thermocycler, ja, Sumir hat ja schon gemeint, dass die Temperatur da sich ändert während der verschiedenen Schritte und das wird ganz oft hintereinander gemacht. Und dieses Gerät können wir jetzt quasi kreuzen mit einem Photometer. Und dessen funktionere ich später noch genauer erklären.

11:41 Aber dann können wir nämlich noch was richtig Cooles machen, eine sogenannte quantitative PCR. Und wie gesagt, die PCR mit der Gele-Elektrophorese, die ganz normale, kann nur die qualitative Aussage bieten, ob zum Beispiel ein bestimmtes Gen vorhanden ist. Bei der quantitativen PCR oder auch QPCR, da entsteht aber bei jeder Polymerase-Reaktion, also in jedem Zyklus, ein Lichtsignal, also eine Fluoreszenz.

12:08 Und diese Fluoreszenz ist umso stärker, je mehr Ausgangsmaterial vorhanden ist. Das wird mit dem Photometer dann gemessen, wie stark das eben leuchtet. Und dadurch haben wir einerseits direkt die qualitative Auswertung integriert, also im Sinne von, gibt es überhaupt ein Signal, ist dieses Gen vorhanden.

12:30 Das heißt, wir brauchen die Gele-Elektrophorese überhaupt nicht mehr. Und andererseits kann man dabei zum Beispiel sowas wie Viruslasten bestimmen. Je mehr Virus-Genom letztendlich da ist zum Beispiel, je mehr Virus-DNA da ist, desto weniger Zyklen sind nötig, bis das Lichtsignal eine bestimmte Stärke erreicht.

12:51 Jetzt die Preisfrage, ist das SARS-CoV-2-Virus ein DNA oder ein RNA-Virus?

12:57 Ein RNA-Virus.

12:59 Okay. Man kann nämlich auch einmal auch RNA mit PCR nachweisen, indem man die RNA zur DNA zurückübersetzt. Dafür gibt es im Menschen kein Enzym, aber es gibt bestimmte Viren, die Retroviren, die können sowas. Das heißt, man kann letztendlich auch RNA analysieren. Und bei so Covid-PCR-Tests gibt es immer den CT-Wert, das ist die sogenannte Cycle Threshold.

13:25 Habt ihr bestimmt schon mal gehört mittlerweile. Bis zum Abwinken.

13:30 Und letztendlich ist der Punkt, man macht ja immer Zyklen. Und je niedriger dieser CT-Wert ist, desto weniger PCR-Zyklen sind nötig, bis zum ersten Mal diese Fluoreszenz eine bestimmte Schwelle erreicht hat, eine bestimmte Stärke. Und diese QPCR, da arbeitet man immer mit extrem kleinen Mengen und mir wurde jetzt schon mehrmals im Labor gesagt, dass man ultra aufpassen muss beim Pipetieren, dass man ja kein Tröpfchen noch irgendwie an der Pipette unten dran hat, weil das alle Ergebnisse versaut.

14:01 Das heißt, das ist immer ein bisschen ein Pain, eine Q-PCR zu machen, aber sie kann richtig viel aussagen. Genau.

14:07 Und bevor wir weitermachen, ein kleiner Einwurf noch. Ich muss sagen, bevor ich das in echt gesehen habe, ich dachte, so eine PCR-Maschine wäre so richtig groß. Ja, ich dachte, das wäre so ein fettes Ding. Ich meine, das macht so krasse Sachen, aber das ist ja wirklich einfach wie so eine Kästchen. Wie so ein Kästchen.

14:24 Wie so eine Mikrowelle irgendwie. Ja, eigentlich sogar noch klein. Also das, was wir da hatten, das war ja mehr oder weniger so Banane mal Banane ungefähr. Okay. Spannende Maßinheit.

14:34 Banane mal Banane.

14:36 Also wirklich kleiner als man denkt. Also das fand ich total faszinierend. Naja.

14:41 Genau, aber das ist der neueste Schrei von wegen PCR-Geschichte, DNA-Analysierung, aber Oldword Gold, Sanger.

14:54 Genau, also beschäftigen wir uns jetzt mit der DNA-Sequenzierung oder auch der Sänger-Sequenzierung. Und im Grunde funktioniert das Ganze ähnlich wie die PCR, die wir gerade gemacht haben. Deshalb gehen wir auf die einzelnen Schritte auch nicht so genau ein. Die Besonderheit ist, dass wir hier nicht nur die ganz normalen Desoxiribonukleotide, also die normalen Bausteine, verwenden, wie DATP, DTTP und so weiter, sondern es gibt in diesen Versuchsprotokoll quasi vier einzelne Ansätze, die wir aufteilen.

15:27 Und in jedem dieser Ansätze kommt letztendlich alles rein, was man für eine normale PCR braucht, auch die normalen Basen. Und zusätzlich kommt jeweils eins von den Nukleotiden als 2-, 3-Strich D-Desoxinukleotid rein. Also zum Beispiel DDATP und so weiter. Genau. Und wenn wir uns DATP als roten Lego-Baustein vorstellen, dann stellen wir uns DDATP als Baustein, der oben glatt ist, wo man diese, wie nennst du die, Leo?

16:02 Die Nipsis. Die Nipsies. Die Nipis fehlt, wo man die abgemacht hat. Genau. Letztendlich kann also an so ein D des Oxynokleotid, weil die 3-OH-Gruppe fehlt, keine Polymerisierung erfolgen. Da kann nichts mehr weiter dranbinden. Das heißt, es kommt an diesen Stellen, wo der eingebaut wird, immer zum Strangabbruch.

16:22 Wir haben jetzt also vier verschiedene Ansätze und in jedem ist jeweils eins von den D-Desoxinokleotiden drin. Und jetzt ist die Konzentration von diesen glatten Lego-Bausteinen, also von diesen Strang abbrechenden Nukleotiden, ist relativ gering. Deshalb wird auch nicht an jeder Stelle, wo normalerweise ein ATP eingebaut würde, wird ein DD-ATP eingebaut, sondern nur ab und zu mal.

16:49 Und deshalb bekommen wir jetzt eine Ansammlung von DNA-Strängen unterschiedlicher Länge, die dann immer an verschiedenen Stellen eben abgebrochen werden. Aber eben immer, wenn diese bestimmte, die des Oxybase eingebaut wurde.

17:06 Also immer der gleiche, gleichfarbige Legostein ohne Nipsis.

17:10 Genau. So, und jetzt sind diese immer gleichfarbenen Lego-Bausteine ohne Nipsis, ja, diese glatten Bausteine, die sind noch markiert, irgendwie radioaktiv oder mit einer Fluoreszenz. Stellen wir uns also vor, die leuchten tatsächlich zum Beispiel rot und der nächste dann grün, der nächste blau, der nächste gelb.

17:30 So, und dann haben wir also verschiedene Farben. Dann trennen wir das Ganze wieder mittels Elektrophorese auf und dann können wir einfach anfangen beim kürzesten Strang. Quasi, der muss ja dann die einzelne Base haben. Und der nächste Strang ist dann, der nächstlängere hat dann die Base 2 als Abbruch und so weiter.

17:51 Und dann können wir einfach die Sequenz ablesen. Wir müssen es natürlich dafür super oft machen, dass es wahrscheinlich genug ist, dass diese einzelnen Stränge mit dieser Länge überhaupt vorliegen. Aber dann kann man das machen.

18:04 Ja, dafür gibt es heute Maschinen für. Also da sitzt nicht irgendein armer Hevi und macht das alles per Hand, sondern da gibt es heute Riesenaparillus für, sagt man doch, glaube ich. Genau, aber auch dafür braucht man am Ende wieder eine Elektrophorese. Und deswegen ist die Frage, war denn das überhaupt?

18:22 Genau, hatte ich vorher ganz kurz schon mal angerissen. Im Prinzip ist auch nicht so wild. Die Moleküle, die wandern abhängig von ihrer Ladung und abhängig von ihrer Größe durch eine Matrix durch. Und wie passiert es jetzt? Man legt eine Spannung an. Also auf der einen Seite ist die Kathode, die ist positiv geladen, auf der anderen Seite ist die Anode oder ist das andersrum?

18:40 Andersrum.

18:41 Zur Anode wandert die Anionen, das heißt die positiv, genau. Ich wechsle das auch immer.

18:47 Genau, also zur Anode wandern die Moleküle hin. Und so kommt es eben zu einer Auftrennung von zum Beispiel DNA-Fragmenten nach ihrer Länge und dann entstehen eben die Banden und dann kann man ablesen, okay, das kürzeste ist am wenigsten weit gewandert und deswegen ist es am größten. Ja, genau. Zum Beispiel.

19:06 So, ein weiteres Grundprinzip, was wir uns jetzt noch angucken wollen, ist wirklich das Highlight der Biochemie-Praktika. Irgendwie kommt einfach in jedem Versuch vor, das ist die Photometrie. Ja, das Grundprinzip dahinter ist, dass Licht, das durch eine Flüssigkeit durchtritt, in seiner Intensität geschwächt wird.

19:30 Das haben wir eigentlich alle im Alltag irgendwo schon mal erlebt.

19:33 Letztens erst erlebt, weil Leo abends im Hof gesessen und Leo hat so eine Kerze, die eigentlich eher so einem Inferno ähnelt.

19:39 So eine Citronella-Kerze, die kennt es.

19:41 Und im Dunkel wird man da richtig von geblendet. Also haben wir schön eine Flasche Wein davor gestellt, ja, und dann wird das Licht schön gedämpft und dann ist es wieder angenehm.

19:50 In dem Fall war Tim das Fotometer. Schöne Metapher.

19:55 Also die Eigenschaft der Flüssigkeit, die wir jetzt hier betrachten wollen, ist die Absorption. Und die Absorption nennt man eben auch Extinktion. Und je nach Molekül ist diese Extinktion in einem bestimmten Wellenlängenbereich maximal.

20:09 Genau, die Extinktion für ein bestimmtes Molekül, nehmen wir zum Beispiel NAD, die ist allgemein abhängig von der Wellenlänge eben. Also es gibt immer irgendwo im Wellenlängenspektrum einen Peak, wo genau dieses Molekül besonders gut absorbieren kann. Dann ist auch abhängig davon, welche Konzentration von diesem Molekül man in der Lösung hat.

20:28 Sehr logisch, ob ich eine grüne Weinflasche nehme oder eine durchsichtige Weinflasche.

20:33 Genau, beziehungsweise eher, wie viel Wein da drin ist.

20:36 Ja, stimmt, ja.

20:38 Und wie viel Wasser, wenn du wieder Weinschorle machst. Ja, egal. Es ist aus der Konzentration abhängig und auch von der Länge des Lichtweges in der absorbierenden Lösung, also einfach wie dick ist die Követte, die ihr in dieses Photometer reinstellt.

20:50 Ist dankenswerterweise aber eigentlich immer ein Zentimeter.

20:53 Ja, ja, richtig gut gemacht. Und abgebildet wird das Ganze im Lambert-Baer-Gesetz. Das besagt einfach nur, E ist gleich Epsilon mal C mal D, bedeutet, die Extinktion ist das Produkt aus einem Koeffizienten, nämlich dem molaren Extinktionskoeffizienten. Und der ist immer spezifisch für ein Molekül und für eine bestimmte Wellenlänge, ist in der Regel angegeben.

21:17 Außerdem wird das multipliziert mit C, also der Konzentration, und mit D, also der Schichtdicke, die uns aber meistens relativ egal ist, weil sie eben meistens 1 Zentimeter ist. Genau, und dieses Prinzip bedeutet dann, wenn wir ja die Schichtdicke kennen und den Extinktionskoeffizienten, dann können wir von der Extinktion auf die Konzentration schließen.

21:42 Und dieses Prinzip wird super oft verwendet. Das wird wirklich rauf und runter verwendet. Und oft nimmt zum Beispiel die Extinktion dann ab, wenn ein Stoff ausfällt und dann auf dem Boden der Küvette landet und die Lösung somit durchsichtiger wird. Oder man nutzt zum Beispiel aus, dass das NADH bei 340 Nanometer Wellenlänge absorbiert, das einfache NAD aber nicht.

22:06 Und dann kann man zum Beispiel eben einfach 340 Nanometer Wellenlänge am Photometer einstellen. Und dann müsste man im Grunde nur die Veränderung von NADH. Und genau, wie gesagt, das Ganze wird immer mit so einem Photometer gemessen.

22:21 Das ist halt dazu da, um so Enzymaktivitäten zu messen. Also quasi, man kann ja nicht an sich messen, wie geil so ein Enzym drauf ist, aber ich kann halt eben genau so bei so einer Reaktion von NADH zu NAD mir ein Enzym nehmen, was genau diese Reaktion macht. Und da kann ich gucken, wie schnell kriegt das das NADH zum NAD umgebaut.

22:38 Und somit kann ich sagen, so schnell und so geil ist das Enzym drauf.

22:41 Und das mache ich wiederum darum, dass darüber, dass ich die Extinktion messe, was ja eigentlich dann wieder auf die Konzentration zurückführt.

22:49 Okay, also.

22:50 Genau, also wenn es eine, wenn es wirklich, wenn es eine Formel gibt, die man nicht nur kennen, auswendig kennen, sondern auch verstanden haben sollte, dann ist es wirklich die. Also das lohnt sich wirklich und die ist auch wirklich nicht schwierig. Deswegen das auf jeden Fall merken.

23:03 Okay, so. Dann spannen wir den Bogen wieder zur DNA. Die DNA wird ja am Ende in mRNA umgesetzt, um zu einem Protein zu werden. Jetzt kann man die DNA runter und drauf untersuchen, wie wir jetzt gerade gemerkt haben. Man kann aber auch sich genauer die Proteine isolieren und anschauen. Also wird auch quasi das übersetzt, was wir am Ende halt eben auch gemessen haben.

23:32 Liebe Freunde der Vorklinik, bevor es losgeht, brauchen wir noch ganz kurz eure Hilfe. Wir sind nominiert beim Deutschen Podcast-Preis in der Kategorie Beste Information. Diese Kategorie wird über ein Publikumsvoting entschieden und wir brauchen eure Stimme. Hierbei würdet ihr uns unfassbar helfen, wenn ihr kurz auf den Link in der Folgebeschreibung klickt.

23:52 Und uns eure Stimme gibt. Dauert nur 5 Sekunden. Ihr seid die allerbesten. Viel Spaß bei der Folge.

24:03 Nehmen wir dem lieben Leo jetzt also mal etwas Blut ab und schauen uns das Hämoglobin an, was da in den Erythzyten rumschlummert.

24:10 Also wenn ich das Blut abnehme, dann tut ihr das nicht weh.

24:13 Oh, okay, okay.

24:14 Also die Proteinenanalytik, was haben wir dazu jetzt? Welche Eigenschaften können wir bei Proteinen bestimmen? Einmal quantitativ die Konzentration und natürlich das Molekulargewicht. Und qualitativ können wir einen spezifischen Nachweis erwirken. Das bedeutet, wir wollen wissen, ist Proteinen XY, weiß ich nicht, irgendein LDH zum Beispiel, die Laktatdehydrogenase, ist die in unserer Probe drin?

24:38 Das können wir jetzt nachmessen. Da gibt es verschiedene Reaktionen, die man dafür verwenden kann. Und eine davon ist die Bioret-Reaktion. Das Grundprinzip ist, dass Stickstoffatome von Peptidbindungen in einem alkalischen Milieu Komplexe mit Kupferionen bilden. Und wenn sie diese Komplexe bilden, dann entsteht eine blaue Farbe.

24:59 Und diese Farbe, die können wir sehen. Und die Farbintensität ist eben proportional zur Zahl der Peptidbindungen und unabhängig von der Aminosäurezusammensetzung. Das bedeutet, je mehr Peptidbindungen, desto blauer ist unsere Reaktion oder desto blauer ist unsere Bande. Und gemessen wird diese Intensität, aber nicht jetzt einfach nur mit den Augen, guckt man naja, ist es jetzt ein bisschen mehr blau oder weniger blau, sondern dafür verwenden wir wieder das Photometer.

25:26 Und zwar stellen wir dann das Absorptionsmaximum, also wir stellen die Wellenlänge auf 546 Nanometer ein. Da ist das Absorptionsmaximum dieser Komplexes. Genau, dieses Komplexes. Und bei dieser Wellenlänge würde man dann eben die Extinktion messen und daraus kann man dann mit Hilfe der Formel, die wir gerade schon besprochen haben, der Lambert-Baer-Formel, die Konzentration berechnen.

25:50 Ein Problem daran ist jetzt, dass hier eine relativ hohe Nachweisgrenze vorliegt. Das bedeutet, wir brauchen viel Protein, um nachzuweisen, ob es überhaupt da ist. Und dann gibt es eben eine Alternative, das ist die Bradford-Methode. Da benutzt man einen Farbstoff, der an sich basische und hydrophobe Aminosäuren bindet.

26:11 Das hat den Vorteil, dass die Nachweisgrenze hier niedriger ist. Dafür ist es aber abhängig von der Aminosäurezusammensetzung. Also wenn wir jetzt viele Basen, äh, viele Aminosäuren haben, die sauer sind, dann hilft uns das in dem Fall nichts, weil die nicht erfasst werden davon.

26:26 Genau. Und jetzt haben wir eben schon einmal die Biore-Reaktion, womit wir Proteinkonzentration messen können. Jetzt schauen wir uns an, wie wir das Molekulargewicht von Proteinen bestimmen können. Und dafür nutzt man die SDS-Page oder auch Sodium, Dodicylsulfat, Polyacrylamid, Gel Elektrophorese.

26:46 Gesundheit.

26:48 Und die funktioniert jetzt folgendermaßen. Es ist gar nicht so wild. Das SDS sorgt einfach dafür, dass die Proteine entfaltet werden. Außerdem gibt man in der Regel noch ein Reduktionsmittel, wie zum Beispiel das Beta Mercaptoethanol dazu, was dafür sorgt, dass die Sulfidbrücken reduziert und dadurch gespalten werden.

27:08 Das stinkt, Junge. Aber nutzend, das habe ich schon fast vergessen. Das Ding, wie das Ding machst du auf. Checkst du die Felderin macht es wieder zu und gerade jetzt, das hängt dir in der Maske und ich habe wirklich fast mal mein Mittagessen aber durch den Kopf gehen lassen. Ist das zu eklig? Entschuldigung, aber das muss ich kurz mal los.

27:26 Sorry an alle, die gerade essen oder kochen.

27:29 Boah, das riecht wie faule Eier. Na gut, das SDS lagert sich auf jeden Fall an Proteine an und das gibt denen, also das SDS ist an sich negativ geladen und es gibt den Proteinen eine negative Ladung, die proportional zur Größe dieser Proteine ist. Und das ist ziemlich cool, weil jetzt kann man wieder Spannung anlegen und die Proteine laufen abhängig von ihrer Masse Richtung Pluspol, also Richtung Anode.

27:56 Und werden eben durch das Gel, was als Molekularsieb fungiert, nach Größe aufgetrennt. Dann fährt man die Proteine, um sie sichtbar zu machen, zum Beispiel mit Komma Sieb, Brillantblau, ist da so ein typischer Farbstoff. Und dann sieht man die. Und um jetzt überhaupt zu verstehen, wie groß die sind, lässt man immer noch ein extra Proteinemisch mitlaufen, das Proteine bekannter Größe enthält.

28:22 Und das lässt sich dann wie so ein Lineal nutzen, um die Größe der übrigen Proteine abzulesen. Wir würden jetzt zum Beispiel bei Leos Hämoglobin eine dicke Bande bei 16 Kilodolten sehen. Das ist das Molekulargewicht. Und das ist eben das Gewicht der Hämoglobin-Monomere aus Leos Blut. Dazu sehen wir bestimmt auch noch ein paar andere Banden, zum Beispiel für die Carboanhydrase, also ein Enzym in den Erythrozyten und ähnliches.

28:50 Und wenn wir jetzt rausfinden wollen, ob diese Bande, die wir da bei 16 Kilodoluten sehen, wirklich diese HB-Monomere sind, weil es steht ja nicht drauf geschrieben, hallo, ich bin Hämoglobin, dann müssen wir dafür einen spezifischen Nachweis durchführen. Dafür gibt es den Westernblood. Dabei werden die Proteine nach der Auftrennung durch die SCS-Page auf eine Membran übertragen.

29:14 Und das Bandenmuster bleibt gleich. Also im Prinzip einfach so ein Abklatsch. Und es folgen dann mehrere Schritte, bei denen letztendlich ein spezifis Antikörper für das gesuchte Protein hinzugegeben wird. Also in unserem Fall, wir wollen jetzt wissen, ist das wirklich Hämoglobin, also ein Hämoglobin-Antikörper.

29:30 Und genau, der wird dann eben da drauf gegeben. Antikörper bzw. dann Sekundärantikörper enthalten dann eben eine Fluoreszenz oder ein Enzym, das dann dafür sorgt, dass ein Farbstoff entsteht. Und wenn das passiert, sieht man, wo die Antikörper gebunden haben und dann eben auch, ob und wo das gesuchte Protein vorkommt.

29:49 Ganz kurz zu einer Erklärung, weil man da irgendwie immer wieder mal drüber stolpert mit Antikörper und Sekundärantikörper. Die Sekundärantikörper binden an den primären Antikörper, von dem wir gerade gesprochen haben. Und die können dann eben diese, enthalten dann diese Fluoreszenz. Und der Punkt ist einfach nur, dass es, also warum man das macht, ist, dass es zu teuer wäre, jeden normalen Antikörper mit dieser Fluoreszenzfähigkeit jetzt in Anführungsstrichen ganz vereinfacht, auszustatten.

30:15 Es wäre einfach teurer und deswegen gibt es dieses Zweistufensystem.

30:18 Genau, letztendlich. Es ist eigentlich ganz simpel. Man hat immer diesen Primärantikörper und die ganzen Primärantikörper haben so ein Stück, was bei jedem gleich ist, an das die Sekundärantikörper binden können und dann nimmt man halt einen Sekundärantikörper für alle möglichen Primärantikörper.

30:34 Und jetzt kann man noch diesen, jetzt haben wir ja vorher quasi unser Antigen, also das Protein, festgeklebt und den Antikörper draufgeworfen. Jetzt kann man aber auch andersrum den Antikörper festkleben und das Protein draufwerfen. Das hat jeder schon mal gemacht.

30:50 Jetzt vor allem in den letzten zwei Jahren. Das ist eben genau das gleiche Grundprinzip, dieser Eliza, also Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay heißt, müsst ihr euch nicht merken. Und das ist das Grundprinzip von diesen Schnelltests, von den Antigen-Schnelltests, die wir jetzt für SARS-CoV-Kennen, aber auch für Schwangerschaftstests.

31:05 Genau. Es gibt übrigens neben dem Western Blot gibt es auch den Southern Blood, den Northern Blood und den Eastern Blot. Und der Name von diesen ganzen komischen Blots kommt eigentlich von dem Sir Edwin Southern. Und das war ein britischer Molekularbiologe, der diesen Southern Blood eben entwickelt hat.

31:28 Das ist einfach ein DNA-Nachweis letztendlich. Ähnlich gemacht, auch mit Auftrennung. Und dann haut man da keinen Antikörper, sondern eine Oligonukleotidsonde drauf und kann dann bestimmte DNA nachweisen. Gleiches Prinzip beim Northern Blood, bloß dass man hier RNA nachweist. Und beim Eastern Blood, da weist man wieder Proteine nach.

31:53 Allerdings weist man da nicht die Proteine an sich, sondern posttranslationale Proteinmodifikationen nach.

32:01 Jo, Träumchen. Also haben wir jetzt DNA, wir haben RNA und leidiges Thema bleibt zum Schluss das Fett.

32:16 Die Lipide, genau. Und in der Lipidanalytik haben wir jetzt zwei besonders wichtige chromatografische Methoden. Und zwar einmal die Gel-Filtrationchromatografie, also auch Säulenchromatografie genannt, und die Dünnschichtchromatografie. Es gibt auch andere Möglichkeiten, die gehen aber jetzt ehrlich gesagt über das Biochemie-Grundwissen, was ihr in der Vorklinik braucht, hinaus.

32:40 Deswegen würden wir da jetzt nicht weiter drauf eingehen.

32:44 Schauen wir uns also mal eine Biopsie aus Leos Fettpolster an. Oh yeah. Die Bikini-Figur. Nein, eigentlich hat Leo schon eine Bikini-Figur. Jetzt geht es über das.

33:00 Eher so ein Leuchlein, ja. Okay.

33:03 So, okay, zurück zum Thema. Das Grundprinzip ist, es existiert eine stationäre Phase, die ist unbeweglich, und eine mobile Phase, also eine bewegliche Phase. Und die Komponenten des Lipidgemischs werden dann aufgrund unterschiedlicher Wechselwirkungen mit der stationären Phase mehr oder weniger stark zurückgehalten.

33:22 Das heißt, die stationäre Phase ist das, was wir an Gerätschaften vorher schon da haben. Das ist diese Säule. Und die mobile Phase ist das, was wir reingeben, was wir analysieren wollen.

33:35 Bei der Dünnschichtkomatografie, da hat man so eine Platte und diese Platte, da, die hat so ein Kieselgel da drauf und das ist da die stationäre Phase. Dieses Kieselgel, das ist, glaube ich, ein Siliciumoxid, das besitzt auf jeden Fall an der Oberfläche freie OH-Gruppen und das sorgt dafür, dass sich hier starke intermolekulare Wechselwirkungen mit polaren Stoffen ausbilden können.

34:00 Es ist dabei immer relevant, welches Laufmittel man hat, weil wenn da zum Beispiel Wasser, also ein polarer Stoff, enthalten ist, dann konkurriert das Wasser mit polaren Lipiden um die Bindungsstellen am Kiesel gehe und dann laufen polare Lipide weiter, als sie es sonst tun würden.

34:17 Also das Laufmittel ist im Prinzip einfach die Flüssigkeit oder die Lösung, indem unser zu analysierendes Zeug mit rumschwimmt.

34:26 Genau. Die sogenannte mobile Phase. Und wie schon gesagt, je polarer ein Lipid ist, desto mehr Wechselwirkung kann es mit dieser Kieselgelplatte ausbilden. Und desto weniger weit kann es dann eben auch laufen. Zum Beispiel laufen Phospholipide weniger weit als Triacylglyceride, also Tax. Ein polares Lösungsmittel, wie wenn da zum Beispiel Wasser enthalten ist, das differenziert polare Lipide deshalb besser, weil diese polaren Lipide dann weniger stark mit der Kieselgelplatte interagieren und sich dann noch besser auftrennen können.

35:03 Genau. Und wenn wir jetzt versuchen, uns das Ganze zu merken, erstmal muss man immer überlegen, was kommt in dem, was ich gerade analysiere, überhaupt an Lipiden vor. In Eris zum Beispiel würden alle möglichen Lipide vorkommen, wenn wir jetzt doch wieder auf die Blutprobe gehen. Dann hätte man von Polar nach Unpolar Ganglioside, dann PS, also Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin und dann das Cholesterin.

35:35 Und im Gehirn wäre nach dem Phosphatidylethanolamin, käme noch Cereproside. Und das hat sich jetzt bestimmt kein Mensch gemerkt. Deshalb haben wir versucht, uns dafür eine Merkhilfe zu überlegen.

35:48 Ihr wisst ja alle mittlerweile, ich liebe Merkhilfen und zwar folgende: Ein ganz schön cooler Emo zerfährt Kohlrüben. Und wir stellen uns das jetzt bitte alle wirklich bildlich vor, wie da so jemand richtig schwarz angezogen, schwarze Fingernägel, lange Haare, so ein langer Ledermantel, der sitzt auf einem kleinen roten Trecker.

36:07 Klein roter Traktor heißt es, und fährt dann über so ein Feld und zerfährt da die Kohlrüben, die da im Feld drin gesteckt sind. Was hat es jetzt mit unseren Lipiden zu tun? Ganz sind die Ganglioside, schön Phosphatidylserin, also einfach der Anfangsbuchstabe S. Der Kohle, also Emo, steht für das Phosphatidylcholin, Emo sind Phosphatidylamethanolamin, Zerpferd sind die Cerebroside, also das ist aber nur im Gehirn, und die Kohlrüben, das Cholesterin.

36:42 Ich würde euch vorschlagen, dass ihr euch das einfach nochmal irgendwo aufschreibt und zusammen mit so einer Dünnschichtchromatografie nochmal anguckt, damit ihr diese Verknüpfung machen könnt, weil es jetzt wirklich sehr wild ist. Aber zum langfristigen Merken einfach dieses Bild einmal vorstellen von diesem coolen Emo, der die Kohlrüben auf dem Felser fährt, auf dem Trecker, und dann vergesst ihr das nicht mehr.

37:01 So, das war jetzt zur Dünnschichtchromatografie. Als letztes wollen wir einmal noch auf die Säulenchromatografie kurz eingehen. Da haben wir jetzt die stationäre Phase in einer Säule gepackt und innerhalb dieser Säule sind jetzt so poröse Kugeln. Und die Ausschlussgrenze ist hier jetzt ganz relevant und zwar das kleinste Molekül, das nicht mehr durch die Poren durchpasst.

37:22 Also diese Kugeln, die haben kleine Löcher, Poren. Und durch diese kleinen Poren können dann eben Moleküle durchwandern oder eben nicht. Moleküle, die nicht in diese Poren reinpassen, weil sie zu groß sind, die laufen an den Kugeln vorbei, wenn sie von oben mit ihrem Laufmittel da reingeschüttet werden.

37:40 Und die kleineren Moleküle, die da reinpassen, die laufen innerhalb der Poren und brauchen deshalb viel länger, weil sie ihnen einfach einen weiteren Weg haben durch diese Säule als die großen. Und somit werden Moleküle eben nach ihrer Größe und Form aufgetrennt. Das ist jetzt, wir nennen das gerade zwar bei den Lipiden, aber das funktioniert auch mit allem anderen oder mit sehr vielen anderen verschiedenen Molekülen.

38:00 Wir haben das zum Beispiel damals mit Hämoglobinen und Desoxihämoglobin und Methemoglobin und so weiter gemacht. Also es geht auf verschiedenen, kann man in verschiedenen Bereichen anwenden. Und ich muss sagen, für mich war das immer ein bisschen kontraintuitiv. Ich dachte, dass die kleinsten Moleküle sich irgendwie am schneidigsten da durchwinden können und dann am schnellsten unten ankommen.

38:20 Das ist aber in dem Fall eben genau andersrum.

38:22 Genau, so. Das heißt, abschließend sollte man sagen, man sollte sich vorher überlegen, was will ich untersuchen, wenn ich meine Nobelpreisarbeit anfange. Oder einfach das Biochemiepraktikum. Das Biochemiepraktikum ist beides ungefähr gleich schwierig. Und dementsprechend die Methoden anpassen. Als wichtigste Geschichte Photometrie ist eigentlich überall mit dabei.

38:42 Der Herrn Lambert Bär nochmal Extinktion gleich Epsilon mal C mal D, um es nochmal zu wiederholen. Und auch nochmal als kleinen Abschluss der Hit unseren Merkspruch von Polar nach Unpolar für die Lipide. Ganz schön cooler, Emo zerfährt. Kohlrüben, Ganglioside, PS, PC, PE, Cerebroside und die Kohlrüben.

39:08 Genau, falls ihr euch das jetzt nicht merken. Genau, falls ihr euch das jetzt nicht merken könnt, nächste Woche kommt dann auf Instagram nochmal, at der Vorklinik-Podcast, der Merkspruch online. Dann gibt es außerdem nochmal am Montag der MC-Frage zur heutigen Folge und ab und zu auch mal ein paar Bilder von unseren Gesichtern.

39:26 Ihr könnt auch gerne das Tool nutzen, um uns jederzeit Feedback zu schicken. Da freuen wir uns wirklich immer. Und in diesem Sinne, euch auf die nächste Folge.

39:36 Rollen nimmt den Traktor.

39:37 Ja, ich hoffe wirklich, dass, also ich hatte nämlich das Gefühl, am Ende der Biochemie-Praktik hat man irgendwann gecheckt, dass man eigentlich immer wieder das Zelle gemacht hat. Und ich hoffe, dass ihr das jetzt diese Erkenntnis etwas früher bekommt als ihr.

39:53 Gut. Also dann, das war's zum Sonntag.

40:13 Für die Inhalte in diesem Podcast übernehmen wir keine Gewäre. Der Podcast kann den Besuch von Vorlesungen nicht ersetzen. Wir empfehlen das Studium von einstiegiger Fachliteratur über den Inhalt des Podcasts hinaus.

40:23 Für Risiken und Nebenwirkungen fragen Sie an Arzt und Apotheker.